Peptidi con proprietà antimicrobiche e i loro analoghi ottenuti tramite modifiche.

Abstract: L'aumento osservato della resistenza agli antibiotici è attualmente uno dei principali problemi della medicina moderna. L'uso inappropriato e l'abuso dei preparati disponibili ha significativamente ridotto la loro efficacia a causa della comparsa di un numero crescente di microrganismi resistenti. Le ricerche attuali mirano a sviluppare agenti terapeutici più efficaci che agiscano sugli organismi patogeni attraverso meccanismi di difesa presenti in natura (peptidi antimicrobici) e le loro possibili modifiche, dando origine ai loro analoghi.

Parole chiave: peptidi antimicrobici; modifiche chimiche; ciclizzazione; coniugati di farmaci; lipidazione

Elenco delle abbreviazioni: AMP – peptidi antimicrobici

Il concetto di resistenza ai farmaci

La resistenza ai farmaci è un termine che si riferisce alla resistenza che patogeni e parassiti possiedono contro l'azione dei farmaci. Ciò significa che questi patogeni hanno la capacità di vivere e riprodursi in presenza di un farmaco che dovrebbe causarne la distruzione o l'inibizione, ma ciò non avviene. La resistenza ai farmaci può essere divisa in due tipi: resistenza innata e resistenza acquisita. Mentre la prima è una caratteristica tipicamente associata ai microbi, la resistenza acquisita è il risultato del contatto con un farmaco, attraverso l'alterazione del loro materiale genetico, che porta allo sviluppo della resistenza al farmaco.

Peptidi antimicrobici – caratteristiche

I peptidi antimicrobici (AMP) sono un gruppo di composti composti da 10 a 50 residui di amminoacidi. La carica netta che varia da +2 a +9 deriva dalla presenza di residui di L-arginina, L-lisina o L-istidina nella catena peptidica. La sintesi degli AMP può avvenire in due modi. Il primo avviene tramite la traduzione dell'mRNA ribosomiale presente in tutti gli organismi, mentre il secondo coinvolge la sintesi peptidica non ribosomiale effettuata principalmente dai batteri. I peptidi sintetizzati tramite sintesi non ribosomiale, come gli antibiotici a base di polimixine e gramicidina S, trovano ampia applicazione per la loro attività antimicrobica. Sempre più spesso, tuttavia, a causa delle loro proprietà che stimolano l'immunità innata, trovano applicazione i peptidi prodotti dalla sintesi ribosomiale. I peptidi antimicrobici sono isolati da vari organismi.

Defensine come AMP animali

Il gruppo di peptidi antimicrobici è stato principalmente isolato da pesci, anfibi e mammiferi. La quantità maggiore è stata osservata nei fagociti, neutrofili, macrofagi e nelle secrezioni delle cellule epiteliali. Tra i composti con la maggiore attività biocida vi sono le defensine, grazie alle loro proprietà che permettono la modulazione della risposta immunitaria dell'organismo ospite. Le defensine sono peptidi antimicrobici anfipatici, composti ricchi di residui di amminoacidi basici e L-cisteina, presenti negli organismi animali e vegetali. La loro attività biocida è diretta contro un ampio spettro di batteri Gram-positivi, Gram-negativi e funghi. Si distinguono tre classi di defensine: α-, β- e θ-, che differiscono tra loro per la topologia dei ponti disolfuro.

Le α-defensine più conosciute sono: HNP1-4 prodotte principalmente nella placenta, nel collo dell'utero e nella mucosa intestinale, i composti HD5 e HD6 presenti nelle ghiandole salivari, nella parete del tratto digestivo, nelle vie urinarie e nella mucosa oculare, nonché NP5 presente nelle cellule di Paneth. Le β-defensine costituiscono la classe più diversificata di AMP, essendo state modellate nel più lungo periodo evolutivo grazie alla loro presenza nel materiale genetico di tutti i vertebrati finora classificati. Le θ-defensine, scoperte più recentemente, includono i peptidi RTD1-3. Le defensine mostrano un ampio spettro di attività antimicrobica partecipando attivamente alla difesa immunologica degli organismi; ad esempio, l'α-defensina umana HD5 elimina efficacemente le infezioni causate da Salmonella typhimurium e Staphylococcus aureus, mentre RTD-1 mostra attività biocida contro Escherichia coli.

Peptidi AMP vegetali

I peptidi antimicrobici si trovano in tutte le specie vegetali. Una caratteristica dei peptidi AMP vegetali è la presenza di residui di L-cisteina e di diversi ponti disolfuro, che contribuiscono a mantenere una struttura compatta garantendo resistenza proteolitica e chimica. I peptidi AMP vegetali, che includono in particolare tionine, defensine e ciclotidi, sono composti da 45 a 47 residui di amminoacidi nella catena. Si distinguono due sottogruppi di tionine: 8c, che possiedono otto residui di L-cisteina nella sequenza formando quattro ponti disolfuro, e 6c, che ne hanno sei e corrispondentemente tre legami -S-S.

Peptidi antimicrobici – proprietà

Come metodo innovativo per il trattamento della resistenza ai farmaci, i peptidi antimicrobici sono sempre più utilizzati con successo crescente. Essi mostrano alta attività contro batteri Gram-negativi e Gram-positivi, virus e funghi. Inoltre, i peptidi antimicrobici dimostrano la capacità di neutralizzare le tossine batteriche, inibire le reazioni pro-infiammatorie e i processi di formazione del biofilm, e accelerare la guarigione delle ferite.

Meccanismo di penetrazione degli AMP nella cellula

La penetrazione degli AMP nelle cellule batteriche può avvenire attraverso diversi meccanismi. Nella stragrande maggioranza dei casi, si verifica la disintegrazione delle membrane cellulari microbiche tramite lisi, attraverso interazioni elettrostatiche e idrofobiche tra frammenti carichi positivamente di residui di L-arginina o L-lisina e regioni cariche negativamente delle membrane batteriche. Si distinguono tre modelli principali del modo in cui i peptidi antimicrobici penetrano negli involucri esterni dei microrganismi: il modello barrel-stave, il modello carpet e il modello toroidale.

a) Il modello barrel-stave si basa sull'interazione di peptidi anfipatici con struttura α-elicoidale con la membrana batterica, con la formazione di canali o pori transmembrana con frammenti idrofili rivolti verso l'interno. Ciò fa sì che gli AMP si incorporino nello scheletro lipidico della membrana in posizione verticale e interrompano il potenziale transmembrana e il gradiente ionico. Come risultato di questi fenomeni, la sintesi di ATP è inibita e la permeabilità della membrana aumenta, portando al rigonfiamento cellulare e all'osmosi;

b) Il modello carpet prevede il legame del peptide alla membrana e la formazione di un "tappeto" sulla sua superficie. Le catene peptidiche si dispongono all'esterno della membrana in modo che le loro regioni idrofile siano rivolte verso i frammenti idrofili dei fosfolipidi, e le regioni idrofobiche verso il nucleo della membrana. A seguito di interazioni elettrostatiche, i frammenti carichi positivamente della catena peptidica AMP si legano ai fosfolipidi carichi negativamente, la permeabilità della membrana è limitata dalla struttura a tappeto del peptide e la membrana viene successivamente distrutta, formando infine strutture micellari;

c) Il modello del poro toroidale si basa sull'aggregazione degli AMP sulla superficie del doppio strato lipidico, causando la sua curvatura verso l'interno. Le regioni idrofile della catena peptidica si legano alle teste polari dei lipidi di membrana, portando alla disintegrazione della membrana e alla formazione di pori più grandi rispetto a quelli del modello barrel-stave.

Esempi di modifiche chimiche degli AMP

Nonostante i numerosi vantaggi, i peptidi antimicrobici presentano anche molte limitazioni legate al loro impiego, che portano di conseguenza alla progettazione di analoghi sintetici contenenti la sequenza chiave per l'attività antimicrobica o basati su AMP nativi. Di seguito presentiamo alcuni esempi:

1. Ciclizzazione

Sono noti quattro tipi di ciclizzazione della catena peptidica degli AMP naturali: tra i frammenti N- e C-terminali della catena, tra l'estremità N- o C-terminale della catena peptidica e un gruppo funzionale situato nella catena laterale di uno degli amminoacidi presenti nella sequenza, e all'interno delle catene laterali stesse (Fig. 4). L'effetto di questi processi è un miglioramento della stabilità del peptide, che si traduce in una maggiore resistenza alla degradazione da parte degli enzimi proteolitici. Gli analoghi AMP derivanti dalla modifica di ciclizzazione hanno mostrato proprietà quali: aumento dell'attività antimicrobica contro ceppi di Escherichia coli e Bacillus subtilis, attività biocida contro batteri Gram-positivi (diversi ceppi di Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Corynebacterium bovis) e batteri Gram-negativi (Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae), nonché l'uso di questo analogo AMP nelle ustioni cutanee, nella cura delle ferite post-operatorie e nella prevenzione delle infezioni.

2. Coniugati di farmaci

Un altro tipo di modifica chimica degli AMP è il legame covalente con antibiotici, che migliora la loro attività antimicrobica e riduce la dose terapeutica del farmaco, eliminando così la comparsa di effetti avversi. Gli analoghi AMP derivanti dalla modifica coniugata hanno mostrato proprietà quali: aumento dell'attività antimicrobica contro ceppi di Escherichia coli e Bacillus subtilis, attività biocida contro batteri Gram-positivi, assenza di tossicità per le cellule epiteliali e gli eritrociti umani, attività biocida contro ceppi stafilococcici e uso dell'analogo nel trattamento della polmonite acquisita in comunità, della sinusite batterica acuta e della pielonefrite.

3. Lipidazione

Una delle modifiche post-traduzionali più importanti è la lipidazione, che, oltre a regolare le funzioni di peptidi e proteine, provoca anche un aumento della loro affinità per le membrane cellulari. L'applicazione degli analoghi progettati è determinata dalla quantità e dal tipo di acidi grassi legati e dalla lunghezza delle catene di carbonio. L'incorporazione di gruppi lipidici nelle catene peptidiche consente, tra l'altro, di modificare la solubilità in acqua dei composti di nuova sintesi, la loro capacità di auto-organizzazione e la loro stabilità termica. Gli analoghi AMP derivanti dalla modifica di lipidazione hanno mostrato proprietà quali: aumento dell'attività antimicrobica contro batteri Gram-positivi (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis), batteri Gram-negativi (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa) e funghi (Candida albicans, Candida tropicalis e Aspergillus brasiliensis).

Sintesi

Uno dei problemi significativi della medicina moderna è l'uso frequente di antibiotici, che porta allo sviluppo di nuove specie microbiche resistenti. Un modo per eliminare questo problema crescente può essere l'uso di peptidi antimicrobici, che sono un componente del sistema immunitario innato dell'organismo. Il termine AMP si riferisce più comunemente a composti con carica positiva e struttura anfipatica, responsabile della modulazione delle loro proprietà antimicrobiche contro un ampio spettro di batteri, virus e funghi. Gli elevati costi di produzione e la limitata biodisponibilità degli AMP naturali hanno reso necessaria la ricerca di nuovi composti modello la cui attività si basi su meccanismi precedentemente identificati.

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