Caratterizzazione dei Peptidi. Sintesi e Modifiche dei Peptidi

Parole chiave: peptide; idrolisi peptidica; legami peptidici; modifiche peptidiche; sintesi peptidica; …

Parole chiave: peptide; idrolisi peptidica; legami peptidici; modifiche peptidiche; sintesi peptidica; legame peptidico; ormoni peptidici; analoghi peptidici; salificazione; amidazione; acetilazione

Peptidi

I peptidi sono composti chimici costruiti in modo simile alle proteine, a partire dagli amminoacidi. Si formano unendo due o più amminoacidi tramite un legame peptidico come risultato di un processo di condensazione, nel quale, oltre al peptide, viene prodotta anche una molecola d'acqua. (Fig. 1) Sono oggetto di ampio interesse, svolgendo importanti funzioni biologiche. Molti ormoni e neurotrasmettitori sono infatti peptidi. Nel caso dei peptidi endogeni, agiscono antimicrobicamente, funzionando come sistema di difesa dell'organismo. I peptidi naturali e i loro analoghi sintetici sono considerati composti attraenti di rilevanza terapeutica grazie al loro alto grado di attività, bassa tossicità e assenza di interazioni con farmaci. Nella pratica medica, solo pochi peptidi trovano applicazione a causa dell'instabilità biologica e della rapida degradazione, tuttavia la sintesi peptidica permette di ottenere forme stabili. Lo stesso vale, per esempio, nel caso della sintesi di peptidi da fonti naturali. I peptidi si presentano in forma lineare e possiedono solo due estremità specifiche. Una di esse è chiamata terminazione amminica, dove è presente un amminoacido con un gruppo α-amminico libero. L'altra è chiamata terminazione carbossilica o C-terminale, dove è presente un amminoacido con un gruppo α-carbossilico libero.

Nomenclatura dei peptidi

La nomenclatura dei peptidi inizia con il nome del residuo amminoacidico N-terminale, seguito dai nomi dei residui amminoacidici successivi, e termina con il nome dell'amminoacido C-terminale. La sequenza degli amminoacidi viene registrata utilizzando simboli a tre lettere o a una lettera.

Legame peptidico

Il carbonio, a seguito della reazione del gruppo α-carbossilico, si lega con l’azoto del gruppo α-amminico tramite un legame singolo – un legame peptidico. Si presume che questo legame si formi nella forma di due strutture che rimangono in un equilibrio reciproco specifico. Il legame C-N passa a C=N e viceversa. La rotazione attorno all’asse C=N non è possibile, il che significa che il legame peptidico è abbastanza rigido da possedere le caratteristiche di un doppio legame. Nel caso di un legame peptidico che coinvolge il gruppo imino della prolina o idrossiprolina con il gruppo carbossilico di un altro amminoacido, si forma una struttura diversa e distinta. In questo caso, l’azoto è incorporato nella struttura dell’anello pirrolidinico; non c’è un sostituente idrogeno, il che significa che non è possibile la rotazione rispetto ai legami formati in presenza di azoto. Gli amminoacidi che partecipano alla formazione di un legame peptidico perdono frammenti delle loro molecole – specificamente l’-OH dal gruppo carbossilico e l’-H dal gruppo amminico. Per questo motivo, gli amminoacidi presenti nei peptidi e nelle proteine sono chiamati residui di amminoacidi. I legami peptidici risultanti sono stabili e la loro rottura può avvenire solo sotto l’azione di basi e acidi forti a temperature simultaneamente elevate.

Rottura del legame peptidico

La rottura del legame peptidico avviene come risultato di una reazione di idrolisi peptidica, che si basa sulla rottura dei legami peptidici formati e sul ripristino dei singoli amminoacidi. In questa reazione partecipa l’acqua, le cui molecole si scindono in gruppi ossidrile (-OH) e atomi di idrogeno (H), che si combinano poi con i legami rilasciati della sostanza.

Classificazione dei peptidi

La classificazione dei peptidi si basa sul numero di amminoacidi da cui sono costituiti. Nella classificazione generale dei peptidi, distinguiamo:

• Dipeptidi – prodotti formati dalla reazione di due amminoacidi mantenendo il gruppo amminico libero di un amminoacido e il gruppo carbossilico libero del secondo amminoacido;

• Oligopeptidi – peptidi composti da alcune a oltre una dozzina di amminoacidi;

• Polipeptidi – peptidi più lunghi contenenti diverse decine di residui di amminoacidi;

• Proteine – accettate quando una molecola è composta da più di cento residui di amminoacidi.

Spettro di attività dei peptidi

I peptidi mostrano un ampio spettro di attività biologica e sono utilizzati nel trattamento di infezioni batteriche, malattie virali, malattie cardiovascolari, malattie del sistema scheletrico, malattie del sistema nervoso, diabete e osteoporosi.

Vantaggi dei peptidi

• Alta attività e selettività
• Ampia gamma di bersagli molecolari
• Potenzialmente minore tossicità rispetto ai composti a basso peso molecolare
• Bassa accumulazione nei tessuti
• Alta diversità chimica e biologica
• Riconoscibile a livello genico
• Sintesi facile di analoghi

Sintesi peptidica

A seconda del peptide che desideriamo ottenere, abbiamo bisogno di un metodo di sintesi appropriato. In una breve spiegazione, cercheremo di presentare la sintesi peptidica in relazione alla sua dimensione. Per ottenere un dipeptide, deve essere usato un reagente che attivi il gruppo carbossilico dell'amminoacido arilante, oppure l'amminoacido acilante deve essere convertito in un anidride. Un processo più laborioso e difficile è la sintesi di peptidi più grandi, che si ottengono da un dipeptide, comportando la rimozione del gruppo protettivo dell'amminoacido N-terminale e la sua acilazione con il successivo amminoacido N-protetto. Questo processo è particolarmente dispendioso in termini di tempo, poiché i passaggi sopra menzionati si ripetono fino a ottenere un peptide della sequenza pianificata. Nel caso di peptidi di grandi dimensioni, il metodo Merrifield è l'approccio più efficiente e semplice. Questo metodo viene eseguito su fase solida. L'amminoacido C-terminale viene attaccato a un polimero e poi si aggiungono successivamente gli amminoacidi fino a raggiungere la lunghezza desiderata della catena.

Peptidi biologicamente attivi

Gli ormoni peptidici e proteici sono ampiamente presenti nell'ambiente che ci circonda. In passato erano conosciuti soprattutto come forme relativamente instabili. Sotto l'influenza della sintesi, la terapia peptidica può essere scelta con sempre maggiore sicurezza per essere durevole ed efficace a seconda delle esigenze dell'organismo. È proprio per questo che vale la pena impegnarsi abilmente e in sicurezza nella stimolazione ormonale. Tenendo conto di alcuni peptidi biologicamente attivi, possiamo fare l'esempio del glutatione, che come tripeptide con una struttura specifica è composto da glutammato, cisteina e glicina. Il glutammato si presenta come amminoacido N-terminale. Il legame tra glutammato e cisteina è però atipico per peptidi e proteine, perché qui non è presente il gruppo α-carbossilico del glutammato ma il gruppo γ-carbossilico. Il glutatione si presenta quindi in forma ridotta e ossidata, essendo γ-glutamilcisteinilglicina. Nella forma ridotta possiede un gruppo sulfidrilico libero, mentre nella forma ossidata una coppia di atomi di idrogeno si stacca dai gruppi -SH. Gli atomi di zolfo rimangono privi di idrogeno, portando alla formazione di un ponte disolfuro. La capacità del glutatione di essere modificato in uno stato ossidato o ridotto è importante nei processi di ossidoriduzione.

Ulteriori esempi sono l'ossitocina e la vasopressina, che come nona-peptidi prodotti dai neuroni ipotalamici e rilasciati dalla ghiandola pituitaria posteriore, differiscono solo per due amminoacidi. La cisteina si trova in due posizioni, portando così alla formazione di un ponte disolfuro. L'ossitocina agisce come ormone stimolante l'attività contrattile dell'utero. La vasopressina, invece, stimola il riassorbimento dell'acqua nei tubuli renali. La vasopressina svolge anche un ruolo importante nella regolazione della secrezione dell'ormone adrenocorticotropo (ACTH) in situazioni di stress.

Ormoni peptidici

Ormone adrenocorticotropo (ACTH)

L'ormone adrenocorticotropo, come peptide di 39 aminoacidi, è prodotto come risultato della degradazione di una molecola precursore molto più grande – la proopiomelanocortina (POMC). La proopiomelanocortina serve anche come fonte di altri peptidi attivi. Due peptidi sono contenuti nella struttura stessa dell'ACTH. Questi includono l'ormone α-melanotropo (α-MSH), che è strutturalmente identico ai primi 13 aminoacidi dell'ACTH, e il peptide intermedio simile alla corticotropina – frammento 18-39 dell'ACTH. La funzione principale dell'ACTH è considerata la stimolazione della corteccia surrenale in modo che sia capace di secernere ormoni steroidei. L'ormone adrenocorticotropo è responsabile della regolazione dell'attività a livello della zona fascicolata e della zona reticolare. I primi 18 aminoacidi sono responsabili dell'attività biologica dell'ACTH. La regolazione dell'ACTH avviene tramite l'ormone di rilascio della corticotropina (CRH), un ormone presente nell'ipotalamo, che rilascia la corticotropina attraverso il cortisolo tramite feedback negativo. Ciò significa che una carenza di cortisolo stimola CRH e ACTH, mentre il suo eccesso inibisce la secrezione. Rilasciando cortisolo, vengono così regolate molte funzioni vitali importanti, inclusa la mobilitazione del corpo in condizioni di stress, l'aumento della pressione sanguigna e le capacità antinfiammatorie. L'ACTH secreto in modo pulsatile secondo un ritmo circadiano significa che la sua concentrazione più alta si osserva nelle ore mattutine, quando ciò è più desiderabile, per poi diminuire durante il giorno. Un aumento della secrezione di ACTH si osserva in condizioni patologiche come l'insufficienza corticosurrenalica, la malattia di Cushing o la sindrome di Nelson.

Insulina e peptide C

L'insulina e il peptide C sono secreti nel pancreas dal corpo umano in modo continuo. Durante la produzione di insulina, nel processo della sua biosintesi, viene prodotto il peptide C. Le cellule pancreatiche producono preproinsulina nella prima fase, che subisce ulteriori modifiche attraverso il distacco di aminoacidi, portando alla formazione della proinsulina composta da due catene A e B collegate dal peptide C, seguita dal distacco della proinsulina dal peptide C, risultando nella forma finale. Quando il glucosio compare nel corpo, il pancreas riceve un segnale per rilasciare granuli contenenti le molecole di insulina e peptide C immagazzinate. Il peptide C viene trattenuto nel fegato significativamente più a lungo rispetto all'insulina, a causa del fatto che lì non viene degradato. La sua degradazione avviene principalmente nei reni. Nel caso sia dell'insulina che del peptide C, concentrazioni elevate o eccessivamente basse portano allo sviluppo del diabete di tipo I o II così come della malattia di Cushing. Nel caso del peptide C, le fluttuazioni di concentrazione possono anche indicare insufficienza renale cronica o la presenza di metastasi o recidiva tumorale locale, motivo per cui mantenere norme di concentrazione adeguate è così importante.

Motilina

La motilina è un ormone associato ai muscoli lisci dello stomaco e dell'intestino, controllato dalle fibre del nervo vago. Sintetizzata nelle cellule endocrine. Come ormone peptidico composto da 22 amminoacidi disposti in una sequenza specifica, è prodotta dalle cellule dell'intestino tenue. Prodotta dalle cellule endocrine M (Mo) del sistema digestivo, partecipa alla regolazione della motilità gastrointestinale. La motilina è un ormone importante che partecipa alla formazione della fase III del complesso motorio migrante (MMC), in cui stomaco e intestino tenue hanno il compito di svuotare lo stomaco dai residui alimentari inutili e dalle cellule epiteliali desquamate attraverso la stimolazione dei movimenti peristaltici. L'ormone influenza inoltre lo svuotamento della cistifellea durante il periodo interdigestivo alla massima concentrazione di motilina.

Glucagone

Il glucagone è uno degli ormoni coinvolti nella regolazione della concentrazione di glucosio; questo peptide è secreto dalle cellule endocrine del pancreas. È un polipeptide composto da 29 amminoacidi, prodotto da un precursore con una struttura di 180 amminoacidi. Le variazioni nella concentrazione di glucosio permettono la secrezione di glucagone. La produzione dell'ormone glucagone avviene nelle isole pancreatiche, in cui glucagone e polipeptide pancreatico correlato al glicentina (GRPP) sono prodotti dal proglucagone. Il compito principale del glucagone è mantenere una corretta concentrazione di glucosio nel siero durante il suo calo tra i pasti o durante l'attività fisica. Le sue riserve in tali situazioni vengono rilasciate dal fegato per fornire al corpo una protezione adeguata. Inoltre, può partecipare alla regolazione durante l'assunzione di cibo, il che significa che la sensazione di sazietà può comparire prima. Il glucagone può potenzialmente inibire il rilascio di grelina e anche inibire la peristalsi intestinale.

Analoghi peptidici

Gli analoghi peptidici sono definiti come composti chimici appropriati in cui un atomo è sostituito da un altro rispetto al composto di partenza, mentre la struttura generale del peptide rimane invariata. Gli analoghi peptidici includono analoghi a struttura elicoidale e analoghi a β-giro e β-foglio. Nel primo tipo, le eliche sono uno degli elementi strutturali chiave dei peptidi bioattivi. Stabilizzare brevi frammenti oligomerici in una conformazione elicoidale comporta un aumento dell'attività. Negli analoghi a β-giro e β-foglio, vengono inseriti residui di D-amminoacidi o residui di β,γ,δ-amminoacidi. Gli analoghi peptidici ci permettono di ottenere nuovi composti peptidici che saranno più stabili, troveranno applicazione in uno spettro sintomatico più ampio e consentiranno di risolvere in modo innovativo problemi associati all'azione delle forme pre-analogo esistenti.

Salting-out dei peptidi

Il processo di salting-out comporta la modifica delle cariche proteiche. Le cariche delle proteine vengono neutralizzate dagli anioni e cationi del sale. Le molecole proteiche non si attraggono tra loro e non formano aggregati, e la proteina stessa viene precipitata a seguito della perdita del suo strato di idratazione. Il processo di salting-out è reversibile. Nel processo inverso, il sale viene rimosso tramite dialisi o la sua concentrazione viene ridotta aggiungendo acqua. Sulla base dei nostri articoli precedenti, si può affermare con sicurezza che il salting-out, che ha portato alla formazione di una forma stabile del peptide BPC-157, è un metodo innovativo per garantire la stabilità del peptide e di conseguenza ampliare l'azione biologica dei peptidi.

Acetilazione dei peptidi

L'acetilazione comporta l'attacco di radicali acetile ai substrati, che sono composti con gruppi NH2, OH o SH, con la partecipazione dell'enzima N-acetiltransferasi. La fonte del radicale acetile è l'acetil-CoA. La funzione principale delle N-acetiltransferasi è facilitare il legame del gruppo acetile con il gruppo amminico di ammine aromatiche e idrazine (reazione di N-acetilazione), cioè la detossificazione di composti esogeni potenzialmente tossici.

Amidazione dei peptidi

Quando i legami peptidici si rompono e di conseguenza si verifica la frammentazione della catena polipeptidica, si formano gruppi carbonilici. L'ossidazione di una molecola proteica da parte di un radicale ossidrile inizia con il distacco di un atomo di idrogeno al carbonio α di un amminoacido. Il radicale alchilico risultante reagisce con l'ossigeno formando un radicale alchilperossilico che si trasforma in un alchil idroperossido. Il radicale alcoxilico formato può trasformarsi in un residuo di amminoacido con carbonio α idrossilato oppure può portare alla frammentazione della catena polipeptidica. La presenza di un radicale alcoxilico favorisce la frammentazione della catena polipeptidica. La scissione del legame peptidico può avvenire tramite vie di α-amidazione o diamidazione. Il peptide N-terminale formato durante la frammentazione α-amidica presenta un gruppo ammidico al suo C-terminale, mentre il secondo peptide contiene un derivato N-α-chetoacilico al suo N-terminale. La frammentazione tramite la via diamidica è caratterizzata dalla formazione di un peptide N-terminale contenente una struttura diamidica e un peptide derivato dal C-terminale della molecola proteica contenente una struttura isocianato al suo N-terminale.

Bibliografia

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